A folyadékkromatográfia az alapanyagok, intermedierek, készítmények és csomagolóanyagok egyes komponenseinek és szennyezőanyag-tartalmának vizsgálatának fő módszere, de sok anyag nem rendelkezik szabványos módszerekkel, amelyekre támaszkodni lehetne, ezért elkerülhetetlen az új módszerek kidolgozása. A folyadékfázisú módszerek fejlesztése során a kromatográfiás oszlop a folyadékkromatográfia magja, ezért döntő jelentőségű a megfelelő kromatográfiás oszlop kiválasztása. Ebben a cikkben a szerző három szempontból elmagyarázza, hogyan válasszon folyadékkromatográfiás oszlopot: általános ötletek, megfontolások és alkalmazási kör.
A.Általános ötletek a folyadékkromatográfiás oszlopok kiválasztásához
1. Értékelje az analit fizikai és kémiai tulajdonságait: mint például a kémiai szerkezet, az oldhatóság, a stabilitás (például, hogy könnyen oxidálható-e/redukálható/hidrolizálható-e), a savasság és lúgosság stb., különösen a kémiai szerkezet a kulcs a tulajdonságokat meghatározó tényező, például a konjugált csoport erős ultraibolya-abszorpcióval és erős fluoreszcenciával rendelkezik;
2. Határozza meg az elemzés célját: szükség van-e nagy elválasztásra, nagy oszlophatékonyságra, rövid elemzési időre, nagy érzékenységre, nagy nyomásállóságra, hosszú oszlopélettartamra, alacsony költségre stb.;
- Válasszon megfelelő kromatográfiás oszlopot: ismerje meg a kromatográfiás töltőanyag összetételét, fizikai és kémiai tulajdonságait, például a részecskeméretet, a pórusméretet, a hőmérséklet-tűrést, a pH-tűrést, az analit adszorpcióját stb.
- Folyadékkromatográfiás oszlopok kiválasztásának szempontjai
Ez a fejezet a kromatográfiás oszlop kiválasztásakor figyelembe veendő tényezőket tárgyalja magának a kromatográfiás oszlopnak a fizikai és kémiai tulajdonságainak szemszögéből. 2.1 Kitöltő mátrix
2.1.1 Szilikagél mátrix A legtöbb folyadékkromatográfiás oszlop töltőmátrixa szilikagél. Ez a fajta töltőanyag nagy tisztaságú, olcsó, nagy mechanikai szilárdságú, és könnyen módosítható csoportok (például fenilkötés, aminokötés, cianokötés stb.), de az általa elviselhető pH-érték és hőmérséklet-tartomány korlátozott: A legtöbb szilikagél mátrix töltőanyag pH-tartománya 2 és 8 között van, de a speciálisan módosított szilikagél kötésű fázisok pH-tartománya 1,5 és 10 között is lehet, és vannak speciálisan módosított szilikagél kötésű fázisok is, amelyek stabilak alacsony pH-n. mint például az Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, amely pH 1 és 8 között stabil; a szilikagél mátrix felső hőmérsékleti határa általában 60 ℃, és egyes kromatográfiás oszlopok 40 ℃ hőmérsékletet is elviselnek magas pH mellett.
2.1.2 Polimer mátrix A polimer töltőanyagok többnyire polisztirol-divinilbenzol vagy polimetakrilát. Előnyük, hogy széles pH-tartományt tolerálnak – 1-14 tartományban használhatók, és jobban ellenállnak a magas hőmérsékletnek (80 °C felett is). A szilícium-dioxid alapú C18 töltőanyagokkal összehasonlítva az ilyen típusú töltőanyagok erősebb hidrofób tulajdonságokkal rendelkeznek, és a makropórusos polimer nagyon hatékony a minták, például a fehérjék szétválasztásában. Hátránya, hogy kisebb az oszlop hatásfoka és gyengébb a mechanikai szilárdsága, mint a szilícium-dioxid alapú töltőanyagoké. 2.2 Részecske alakja
A legtöbb modern HPLC töltőanyag gömb alakú részecskék, de néha szabálytalan részecskék. A gömb alakú részecskék alacsonyabb oszlopnyomást, nagyobb oszlop hatékonyságot, stabilitást és hosszabb élettartamot biztosítanak; nagy viszkozitású mozgófázisok (pl. foszforsav) használatakor, vagy ha a mintaoldat viszkózus, a szabálytalan részecskék nagyobb fajlagos felülettel rendelkeznek, ami jobban elősegíti a két fázis teljes hatását, és az ár viszonylag alacsony. 2.3 Részecskeméret
Minél kisebb a részecskeméret, annál nagyobb az oszlop hatékonysága és annál nagyobb az elválasztás, de annál rosszabb a nagy nyomásállóság. A leggyakrabban használt oszlop az 5 μm-es részecskeméretű oszlop; magas elválasztási igény esetén 1,5-3 μm-es töltőanyag választható, amely alkalmas egyes összetett mátrix és többkomponensű minták elválasztási problémájának megoldására. Az UPLC 1,5 μm-es töltőanyagokat használhat; A 10 μm-es vagy nagyobb szemcseméretű töltőanyagokat gyakran használják félpreparatív vagy preparatív oszlopokhoz. 2.4 Széntartalom
A széntartalom a kötött fázis arányát jelenti a szilikagél felületén, amely a fajlagos felülettel és a kötött fázis fedettségével függ össze. A magas széntartalom nagy oszlopkapacitást és nagy felbontást biztosít, és gyakran használják összetett mintákhoz, amelyek nagy elválasztást igényelnek, de a két fázis közötti hosszú interakciós idő miatt az elemzési idő hosszú; Az alacsony széntartalmú kromatográfiás oszlopok elemzési ideje rövidebb, és eltérő szelektivitást mutathatnak, és gyakran használják egyszerű mintákhoz, amelyek gyors elemzést igényelnek, és olyan mintákhoz, amelyek magas vizes fázist igényelnek. Általában a C18 széntartalma 7% és 19% között van. 2.5 Pórusméret és fajlagos felület
A HPLC adszorpciós közeg porózus részecskék, és a legtöbb kölcsönhatás a pórusokban megy végbe. Ezért a molekuláknak be kell jutniuk a pórusokba, hogy adszorbeálódjanak és elkülönüljenek.
A pórusméret és a fajlagos felület két egymást kiegészítő fogalom. A kis pórusméret nagy fajlagos felületet jelent, és fordítva. A nagy fajlagos felület növelheti a mintamolekulák és a kötött fázisok közötti kölcsönhatást, fokozhatja a retenciót, növelheti a mintaterhelést és az oszlopkapacitást, valamint a komplex komponensek elválasztását. A teljesen porózus töltőanyagok ehhez a töltőanyagtípushoz tartoznak. A magas elválasztási követelményekkel rendelkezők számára ajánlott nagy fajlagos felületű töltőanyagokat választani; A kis fajlagos felület csökkentheti az ellennyomást, javíthatja az oszlop hatékonyságát és csökkentheti az egyensúlyi időt, ami alkalmas gradiens elemzésre. A maghéj-töltőanyagok ehhez a töltőanyagtípushoz tartoznak. Az elválasztás biztosításának előfeltétele, hogy a magas elemzési hatékonysági követelményekkel rendelkezők számára kis fajlagos felületű töltőanyagokat válasszunk. 2.6 Pórustérfogat és mechanikai szilárdság
A pórustérfogat, más néven „pórustérfogat”, az egységnyi részecskére jutó üreg térfogatára vonatkozik. Jól tükrözheti a töltőanyag mechanikai szilárdságát. A nagy pórustérfogatú töltőanyagok mechanikai szilárdsága valamivel gyengébb, mint a kis pórustérfogatú töltőanyagoké. Az 1,5 ml/g-nál kisebb vagy azzal egyenlő pórustérfogatú töltőanyagokat leginkább a HPLC elválasztáshoz, míg az 1,5 ml/g-nál nagyobb pórustérfogatú töltőanyagokat főleg molekuláris kizárásos kromatográfiához és kisnyomású kromatográfiához. 2.7 Korlátozási arány
A lezárás csökkentheti a vegyületek és az exponált szilanolcsoportok közötti kölcsönhatás által okozott farokcsúcsokat (például lúgos vegyületek és szilanolcsoportok közötti ionos kötések, van der Waals erők és hidrogénkötések a savas vegyületek és szilanolcsoportok között), ezáltal javítva az oszlop hatékonyságát és a csúcs alakját. . A lezáratlan kötött fázisok eltérő szelektivitást eredményeznek a lezárt kötött fázisokhoz képest, különösen a poláris minták esetében.
- Különböző folyadékkromatográfiás oszlopok alkalmazási köre
Ez a fejezet a különböző típusú folyadékkromatográfiás oszlopok alkalmazási körét írja le néhány esetben.
3.1 Fordított fázisú C18 kromatográfiás oszlop
A C18-as oszlop a leggyakrabban használt fordított fázisú oszlop, amely megfelel a legtöbb szerves anyag tartalom- és szennyezettségi tesztjének, és alkalmazható közepesen poláris, gyengén poláris és nem poláris anyagokra. A C18 kromatográfiás oszlop típusát és specifikációját az egyedi elválasztási követelményeknek megfelelően kell kiválasztani. Például a magas elválasztási követelményeket támasztó anyagok esetében gyakran alkalmaznak 5 μm*4,6 mm*250 mm specifikációkat; összetett elválasztómátrixú és hasonló polaritású anyagok esetén 4 μm*4,6 mm*250 mm specifikáció vagy kisebb részecskeméret használható. A szerző például egy 3 μm*4,6 mm*250 mm-es oszlopot használt két genotoxikus szennyeződés kimutatására a celecoxib API-ban. A két anyag szétválása elérheti a 2,9-et, ami kiváló. Ezenkívül az elválasztás biztosításának előfeltétele mellett, ha gyors elemzésre van szükség, gyakran egy 10 mm-es vagy 15 mm-es rövid oszlopot választanak. Például amikor a szerző LC-MS/MS-t használt egy genotoxikus szennyeződés kimutatására piperakin-foszfát API-ban, egy 3 μm*2,1 mm*100 mm-es oszlopot használtak. A szennyező és a főkomponens elválasztása 2,0 volt, a minta kimutatása 5 perc alatt befejezhető. 3.2 Fordított fázisú fenil oszlop
A feniloszlop szintén egyfajta fordított fázisú oszlop. Az ilyen típusú oszlop erős szelektivitással rendelkezik az aromás vegyületekre. Ha a közönséges C18 oszlopon mért aromás vegyületek reakciója gyenge, megfontolhatja a feniloszlop cseréjét. Például, amikor celecoxib API-t készítettem, az ugyanazon gyártó és ugyanazon specifikációjú feniloszlopon mért főkomponens válasz (mind 5 μm*4,6 mm*250 mm) körülbelül hétszerese volt a C18 oszlopénak. 3.3 Normál fázisú oszlop
A fordított fázisú oszlop hatékony kiegészítéseként a normál fázisú oszlop alkalmas erősen poláros vegyületekhez. Ha a csúcs még mindig nagyon gyors, amikor a fordított fázisú oszlopban 90%-nál nagyobb vizes fázissal eluálódik, és még közel van az oldószercsúcshoz, és átfedésben van vele, fontolóra veheti a normál fázisú oszlop cseréjét. Ez az oszloptípus magában foglalja a hilic oszlopot, az amino oszlopot, a ciano oszlopot stb.
3.3.1 Hilic oszlop A Hilic oszlop általában hidrofil csoportokat ágyaz be a kötött alkilláncba, hogy fokozza a poláris anyagokra adott választ. Ez az oszloptípus cukoranyagok elemzésére alkalmas. A szerző ezt a típusú oszlopot használta a xilóz és származékai tartalmának és rokon anyagainak meghatározásához. A xilóz-származék izomerjei is jól elkülöníthetők;
3.3.2 Amino- és ciano-oszlop Az amino- és ciano-oszlop a kötött alkillánc végén amino- és ciano-módosítások bevezetésére utal, hogy javítsa a szelektivitást speciális anyagokkal szemben: például az amino-oszlop jó választás cukrok, aminosavak, bázisok és amidok elválasztására; A ciánoszlop jobb szelektivitással rendelkezik a hidrogénezett és hidrogénezetlen szerkezeti hasonló anyagok elválasztásakor a konjugált kötések jelenléte miatt. Az amino- és ciano-oszlop gyakran átkapcsolható normál fázisú oszlop és fordított fázisú oszlop között, de a gyakori váltás nem javasolt. 3.4 Királis oszlop
A királis oszlop, ahogy a neve is sugallja, királis vegyületek elválasztására és elemzésére alkalmas, különösen a gyógyszeripar területén. Ez a fajta oszlop akkor jöhet számításba, ha a hagyományos fordított fázisú és normál fázisú oszlopok nem tudják elérni az izomerek elválasztását. A szerző például egy 5 μm*4,6 mm*250 mm-es királis oszlopot használt az 1,2-difenil-etilén-diamin két izomerjének elválasztására: (1S, 2S)-1, 2-difenil-etilén-diamint és (1R, 2R)-1, 2-t. -difenil-etilén-diamin, és a kettő közötti elválasztás elérte a 2,0 körüli értéket. A királis oszlopok azonban drágábbak, mint más típusú oszlopok, általában 1W+/db. Ha szükség van ilyen oszlopokra, az egységnek elegendő költségvetést kell készítenie. 3.5 Ioncserélő oszlop
Az ioncserélő oszlopok alkalmasak töltött ionok, például ionok, fehérjék, nukleinsavak és egyes cukoranyagok szétválasztására és elemzésére. A töltőanyag típusa szerint kationcserélő oszlopokra, anioncserélő oszlopokra és erős kationcserélő oszlopokra osztják őket.
A kationcserélő oszlopok közé tartoznak a kalcium alapú és hidrogén alapú oszlopok, amelyek elsősorban kationos anyagok, például aminosavak elemzésére alkalmasak. Például a szerző kalcium alapú oszlopokat használt a kalcium-glükonát és a kalcium-acetát öblítőoldatban történő elemzésekor. Mindkét anyag erős válaszreakciót mutatott λ=210 nm-en, és az elválasztási fok elérte a 3,0-t; a szerző hidrogén alapú oszlopokat használt a glükózzal rokon anyagok elemzésekor. Több jelentős rokon anyag – maltóz, maltotrióz és fruktóz – nagy érzékenységgel bírt a differenciáldetektorok alatt, a kimutatási határ 0,5 ppm, az elválasztás mértéke pedig 2,0-2,5.
Az anioncserélő oszlopok elsősorban anionos anyagok, például szerves savak és halogénionok elemzésére alkalmasak; Az erős kationcserélő oszlopok nagyobb ioncserélő kapacitással és szelektivitással rendelkeznek, és alkalmasak összetett minták elválasztására és elemzésére.
A fentiek csak bevezetők számos elterjedt folyadékkromatográfiás oszlop típusaiba és alkalmazási területeibe, kombinálva a szerző saját tapasztalataival. Vannak más speciális kromatográfiás oszlopok is a tényleges alkalmazásokban, például nagypórusú kromatográfiás oszlopok, kispórusú kromatográfiás oszlopok, affinitáskromatográfiás oszlopok, multimódusú kromatográfiás oszlopok, ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás oszlopok (UHPLC), szuperkritikus folyadékkromatográfiás oszlopok ( SFC) stb. Különböző területeken játszanak fontos szerepet. A kromatográfiás oszlop konkrét típusát a minta szerkezetének és tulajdonságainak, az elválasztási követelményeknek és egyéb céloknak megfelelően kell kiválasztani.
Feladás időpontja: 2024. június 14